Tıbbi Araştırmalarda Hayvan Kullanımıyla İlgili Kurallar ve Sorumluluklar

 

Araştırma, test etme ve eğitim amacıyla kullanılan hayvanların uygun bakımı, kullanımı ve insani olarak tedavisi için, hem hayvanın bilinmesi gerekli hem de bu amaçla hayvana yaklaşan tüm personelin eğitilmesi gereklidir. Bu bölümde hayvan kullanım ve bakımında uyulması gereken kurallar bildirilmiştir.
Programın yönetilmesi için sorumluluk, genellikle laboratuvar hayvanlarında ve tıpta deneyimli bir kişiye veya eğitimli veteriner hekime verilebildiği gibi, nitelikli bir personele de verilebilir. Deney hayvanları merkezinde deney hayvanlarında veya kullanılan türde eğitimli veya deneyimli, hiç olmazsa bir veteriner hekim çalışmalıdır.

Deney Hayvanının Kullanılma Amacı

1. İnsan, hayvan ve bitkilerin hastalıklardan korunması ve/veya hastalıkların önlenmesi. Bunun için ilaçların, maddelerin veya ürünlerin etkinliğinin, emniyetinin, kalitesinin ve yapımının test edilmesi,
2. İnsan, hayvan ve bitkilerdeki hastalıkların tanısı ve tedavisi,
3. İnsan, hayvan ve bitkilerde fizyolojik koşulların tanısı, belirlenmesi, düzenlenmesi ve modifikasyonu,
4. Çevrenin korunması,
5. Eğitim ve alıştırma,
6. Adli soruşturma,
7. Etik Kurulun kabul edeceği diğer bilimsel araştırmalar için deney hayvanı kullanılabilir.

Hayvan Bakım ve Kullanım Protokolleri.

Tıbbi araştırmanın temel amacı, insan sağlığını düzeltme ve/veya devam ettirmedir. Deneysel işlemlerde zorunlu olmadıkça hayvan kullanımından sakınılmalı, araştırmacı bu canlıların kullanımı için sağlam, bilimsel gerekçeler göstermelidir. Başka seçeneğin niçin olmadığı açıklanmalıdır. Araştırmacı hedeflerini kesin olarak tanımlamalıdır.
Araştırmada hayvan kullanan tüm ilgililer;

• Hayvanların kafeste korunacağını,
• Hayvanların gerekirse deney sonunda öldürüleceğini ve
• Araştırma esnasında hayvanlarda ağrı ya da huzursuzluk oluşabileceğini düşünmelidir. Tüm araştırmacılar hayvanların sağlıklı olmasının,

araştırmanın sonuçlarını da olumlu yönde etkileyeceğini bilmelidir.
Araştırma şu şekilde planlanmalıdır:

• Uygulanabilirliğini;
• Araştırma için fizyolojik olarak en uygun türleri ve olabildiğince basit organizmaların kullanımını;
• Deneyde istatistik hesap yapmaya yetecek en az sayıda hayvan kullanımını;
• Hayvanlar üzerinde yapılan işlemlerin en az düzeyde olmasını; deneyin mümkün olduğu kadar kısa olmasını; ağrıyı en aza indiren analjezi-anestezi-sedasyonun sağlanmasını;
• Önceden yapılmış çalışmaların gereksiz yere tekrarı olmamasını;
• Daha az invaziv uygulamaların, diğer türlerin, izole organ preparatlarının, hücre veya doku kültürlerinin ya da varsa bilgisayar simülasyonunun kullanılma uygunluğu veya olasılığını;
• Deneyin ağrılı ya da stresli olması bekleniyorsa araştırmadan hayvanın çıkarılması ya da ötanazinin; zamanlanmış aralıklarda uygulama yapılacaksa bunun kriterlerini;
• Uygulama sonrası bakımı;
• Ötanazi yöntemini ve hayvanın yok edilmesini;
• Yapılan uygulamalarda personelin deneyimini ve alıştırmanın yeterliliğini;
• Olağan bakım ve bakım gereksinimlerini;
• Personel için çalışma ortamının uygunluğunu araştırmalıdır.

Biyomedikal Araştırmada Hayvan Kullanım Seçenekleri

Tıbbi araştırmanın temel amacı, insan sağlığını düzeltme ve/veya devam ettirme olduğundan gereksinim duyulan araştırmaların çoğunun insanlarda gerçekleştirilmesi etik olarak kabul edilemeyeceğinden, insan yerine hayvan kullanılmalıdır. Biyomedikal araştırma, öğrenme, test etme veya deney amaçlı hayvanları kullanma seçeneklerinin temelleri 3R felsefesi etrafında odaklanır:

1. Replacement (yerine koyma),
2. Reduction (azaltma),
3. Refinement (sadeleştirme).

Replacement, gelişmiş hayvan yerine:

1. Filojenik skalada düşük hayvanları kullanma (böcekler, omurgasızlar),
2. Organ, doku, hücre kültürü gibi in vitro teknikler kullanma,
3. Hayvan olmayan cansız sistemleri kullanma (retroviral gen transferi) veya
4. Canlı olmayan sistemleri (örneğin komputer sistem) kullanılmasıdır.

Reduction ise istatistiksel önemliliği sağlamak için gerekli toplam hayvan sayısını azaltmayı amaçlar.
Refinement, kullanılacak teknik veya işlemi sadeleştirmektir. Bu şekilde hayvana minimal düzeyde ağrı veya sıkıntı verilir. Bu modifikasyondaki amaç, ağrı veya sıkıntıyı daha iyi kontrol etmek, noninvaziv teknik kullanmak, invaziv işlemi azaltmaktır.

Deney Hayvanında Yapılan Araştırmalar

Tıbbi araştırma, özgün amaçlar için hayvanların kullanımını gerektirir. Tıbbi araştırmada kullanılan hayvan tipleri protozooal parazitler gibi en basit organizmadan soğuk kanlı omurgalılara (örneğin kurbağa) ve memelilere (özellikle sıçan ve fare, köpek, kedi, maymun, kobay, tavşan) kadar değişebilir. Hayvanda yapılan girişimler oldukça değişir:

• Hayvanlar deney süresince bilinçli olabilir (örnek ,aşılama veya ilaç uygulaması),
• Uygulama tamamen anestezi altında yapılabilir ancak işlem bitiminde hayvan düzelecektir,
• Uygulama tamamen anestezi altında gerçekleşir, ancak işlem bitiminde hayvan hayatta kalmaz,
• Hayvanlar in vitro kültür için (örneğin tümör hücreleri gibi) doku desteği amacıyla kullanılabilir,
• Hayvanlar antikor, enzim ve kan ürünleri gibi materyal desteği için kullanılabilir.

Deneysel İşlemde Dikkat Edilmesi Gereken Durumlar

Deney genel veya lokal anestezi altında yapılmalıdır. Deney sırasında veya deney sonrasında hayvan ağrı, acı veya sıkıntıya sokulmamalıdır.
Ağrılı veya stresli uygulamalar:

1. Uygun sedatif, analjezik veya anesteziklerle (SAA) yapılmalıdır. SAA bilimsel şekilde ve gerekli aralıklarda kullanılmalıdır.
2. Planlamada veteriner konsültasyonu istenmelidir.
3. Paralitikler, anestezisiz kullanılmamalıdır.

Deneyde analjezi veya anestezinin kullanılması deneyin amacına uygun değilse (deneysel aljezi gibi) yerel Etik Kuruldan izin alınmalı ve deney, cevap alınabilecek en kısa sürede bitirilmeli ve sıkıntı devam ediyorsa ötanazi uygulanmalıdır. Gerekmedikçe böyle bir işlem yapılmamalıdır.
Hayvanın deneyin sonunda canlı kalacağı veya insanca bir yöntemle öldürüleceği belirtilmelidir.

1. Hayvan canlı kalacaksa cerrahi girişim için eldiven, maske, steril alet ve aseptik teknik kullanılmalıdır. Tüm cerrahi uygulamalarda cerrahi işlem öncesi ve sonrası bakım yapılmalıdır. Hayvanın cerrahi işlem sonrasında sıkıntı çekmesi önlenmelidir. Ağrı, huzursuzluk ve sıkıntı çekmesi önlenemiyorsa hayvan daima insanca ve ağrısız olarak öldürülmelidir.
2. Hayvan deneyin bitiminde canlı kalmayacaksa deneyde sterilite gerekli değildir. Uygulama sonrası hayvan insanca ve ağrısız bir yöntemle öldürülmelidir.
3. Öldürülen veya ölen hayvan kendi ürünleriyle birlikte imha edilinceye kadar soğuk odada saklanmalıdır. İmha yalnızca gösterilen özel yerde yakılarak ya da gömülerek yapılmalıdır.
4. Şiddetli veya devamlı ağrı ve sıkıntı verici işlemde kullanılan hayvan, sağlığına kavuşmadıkça ileride yapılacak final deneyde kullanılmamalıdır.

Final deneyi, genel anestezi altında hayvan ölünceye kadar süren bir işlem olabileceği gibi, ufak bir müdahale de olabilir.
Hayvanlara uygulanan madde veya ilaç toksik ise ölü hayvanlar farklı ambalajlarda saklanmalıdır.
Deney sonrasında canlı kalacak hayvana birden çok büyük cerrahi girişim uygulanmamalıdır. Ancak:

1. Bilimsel gerekçe varsa,
2. Veteriner bakım için gerekliyse yapılabilir

Anestezi Uygulanmamış Hayvanlarda Fiziksel Aktivitenin Kısıtlanması

Deneyin amacına uygun olarak hayvanın normal hareketinin tamamının veya bir kısmının sınırlanması için manuel veya mekanik yollarla fiziksel aktivite sınırlanır. Örnek toplama, ilaç verilmesi, tedavi veya deneysel işlem için de fiziksel aktivite kısıtlanabilir. Birçok araştırma uygulamalarında dakikalarla ifade edilen kısa sürelerle hayvan tutulabilir.
Hayvanın ya manuel olarak ya da tutma aletiyle aktivitesi kısıtlanır. Hayvanın yaralanmasını veya huzursuzluğunu en aza indirgemek için bu tutma aletleri boyutu ve şekli, çalışmada uygun olmalıdır. Birçok köpek, maymun veya diğer memeliler kısa süreli hareketsiz kalmaları veya pozitif kuvvet için alıştırılmalıdır. Uzun süreli fiziksel aktivitenin kısıtlanması hayvanda stres yaratabilir; bu nedenle araştırmada temel amaç değilse sakınılmalıdır. Rutin işlemlerdeki kısıtlama hariç tüm fiziksel kısıtlamalar araştırma protokolunda bildirilmelidir. Kısıtlama 4 saatten fazla devam edecekse protokolde detaylı tanımlanmalıdır. Uzamış fiziksel kısıtlılığı kullanmanın uygun olması tek başına yeterli gerekçe değildir. Kısıtlılığın 24 saatten daha fazla sürmesi durumunda, pahalı ve teknik olarak daha zor olsa bile araştırmacıya en az kısıtlayıcı metodun kullanılması fikri önerilmelidir. Uzamış fiziksel kısıtlama gerektiği zaman aşağıdaki kurallara uyulmalıdır:

• Kısıtlama aygıtına konan hayvanlar gerekli kısıtlama zamanına ulaşılıncaya kadar giderek artan kısıtlamayla aygıta alıştırılmalıdır.
• Kısıtlama süresi araştırmacının hedefi için gerekli en az zamanla sınırlandırılmalıdır.
• Genellikle 24 saatten daha uzun süreli çalışmalarda insan dışı primatlarda sandalyeye oturtmak hoş değildir. Uzamış sandalye kısıtlanmasına uygun alternatif yoksa hayvanlar olabildiğince uygun sıklıkta sandalyeden kaldırılmalıdır.
• Kısıtlamayla oluşacak lezyon veya hastalıklara (kontüzyon, dekübitis ülserleri, asılı kalmaya bağlı ağırlık kaybı gibi) dikkat edilmelidir. Böyle bir problem görüldüğü durumlarda veteriner bakımı yapılmalıdır. Bu, hayvanın geçici veya sürekli olarak kısıtlama aygıtından uzaklaştırmaya gerektirir. Hayvanın sağlık problemi veterinerce ciddi görülüyorsa, hayvanın sağlığının düzeltilmesi araştırmada öncelik gerektirir.
• Tutma aletlerinin barınmanın normal yolu olduğu düşünülmemelidir.
• Tutma aletine konan hayvanlar personel ve alete alışması için eğitilmelidir.

Su ve Yiyeceğin Kısıtlanması

Deneysel çalışmalar su ve yiyeceğin kısıtlanmasını gerektirdiği zaman, genç hayvanların gelişimini sağlamaları ve uzun süreli hayvanların iyi kalmaları için gerekli en az miktar su ve yiyecek verilmelidir. Araştırmanın amacı için sınırlama bilimsel olarak onaylanmalıdır. Laboratuvar hayvanlarında yiyecek ve su sınırlanması hayvan için stres kaynağı olup hayvanın kötü davranmasına neden olur. Çalışma yiyecek ve/veya su yoksunluğu gerektiriyorsa hayvanın bulunduğu ortam ve davranışları sıklıkla gözlenmelidir. Vücut ağırlığının günlük kaydı gelişmeyi değerlendirmek için kullanılmalıdır. Vücut ağırlığının normalin %80'inin altına düşmesine izin verilmemelidir. Yiyeceğini serbestçe yiyebilen aynı yaş ve seksteki kontrol hayvanlar, normal vücut ağırlık indeksini saptamada kullanılmalıdır. Bu, özellikle büyüme dönemindeki hayvanlar için önemlidir. Vücut ağırlığında azalma isteniyorsa kalori alımında dereceli bir azalmayla uzun bir sürede gerçekleştirilmelidir. Hedef ağırlığa ulaşmak için tamamen yiyecek yoksunluğu kabul edilemez. Beklenenin altında ağırlık kaybı hayvanın geçici veya sürekli deneyden alınması için bir gerekçedir. Sınırlama günlük gıda alımının yüzdesi veya hayvanın vücut ağırlığının değişme yüzdesi olarak ölçülür.
Su 24 saatten fazla bir süre için tamamen kesilemez. Su sınırlaması (dehidratasyonda) klinik belirtilerin görüldüğü noktaya uzamamalıdır (örneğin, derinin elastikiyetini kaybetmesi, tüylerin kabalaşması, gözlerin göz çukuruna gömülmesi gibi). Akut ve kronik dehidratasyondan sakınmak için günlük sıvı alımı ve vücut ağırlığı hiç olmazsa haftada bir kez gerekirse iki kez kaydedilmelidir.

Araştırma Hayvanlarında İmmünizasyon ve Tam Freund's Adjuvant Enjeksiyonu

Hayvanlarda antikoru artırmak için komple Freud's adjuvantı (CFA)nın kullanımı ağrıya neden olur. Bu nedenle CFA'nın alternatifinin olup olamayacağı araştırılmalıdır. Beklenmeyen immünolojik reaksiyonlara maruz kalan hayvanların sayısını azaltmak için aşağıdaki kurallara uymak gereklidir.
Komple Freud's Adjuvantı
Arzu edilen serum ve antijen miktarına bağlı olarak kobay, fare ve tavşan poliklonal antikorları oluşturmak için kullanılır. Sadece ufak miktarda immünojen olursa CFA kullanılabilir. Şayet immünojen miktarı fazla veya fazla immünojenler varsa diğer adjuvanlar düşünülmelidir. CFA asla intravenöz olarak kullanılmaz. Antijen ile CFA 1:1 oranında karıştırılır. İmmünizasyon yolu hayvanlara bağlı olarak değişir.

1. İntradermal Yol: Bu yol sadece tavşanlarda kullanılır. Bir enjeksiyon yerine 0.5 mL'den fazla inokulum verilmez. Yerin lokalizasyonu sakatlık yapmamak için dikkatlice seçilmelidir. Enjeksiyon yeri olarak skapulalar arası tercih edilir. Minimal sayıda yer kullanılmalıdır ayrıca bu yerler arası oldukça mesafeli olmalıdır. Bu sıklıkla ağrılı olabilir ve enfekte olan deri granülomların drenajına neden olur. Ayrıca, antijen-adjuvant emülsiyonu, enjeksiyon yerinin drenajı ve yara kabuğunun atılması nedeniyle kaybedildiği zaman amaca ulaşılamaz. Enjeksiyon yapan laboratuvar personeli iğne ucunun kendisine batmamasına dikkat etmelidir. Bu insanda ağrıya ve çok uzun süren iltihaba neden olur.
2. Subkutan (s.c.) Yol: Bu yol tavşan, kobay ve farelerde kullanılabilir. Tavşanlarda injeksiyon yeri sırtta skapulalar arası bölge olmalı; her yere 0.1mL verilmeli ve enjeksiyon sayısı en alt sayıda olmalıdır. On yerden daha fazla yer kullanılmamalıdır. Kobaylarda boynun dorsal bölgesinde birçok yere 0.1mL inoküle edilmelidir. Farede 0.1mL'den daha fazla kullanılmaz ve boyun bölgesine verilir.
3. İntramüsküler (i.m.) Yol: Bu yol tavşan, kobay ve büyük kemirgenlerde kullanılır. Ufak kemirgenlerde ve farede önerilmez. Tavşanlar için CFA'da antijenler biseps femoris kasına verilir; her bir yere 0.5mL uygulanmalı ve yer sayısı en az olmalıdır. Kobay veya büyük kemirgenler için biseps femoris kasına 0.1 mL önerilir.
4. İntraperitonea l(i.p.) Yol: Sadece farede kullanılır; 0.1 mL'den daha fazlasına izin verilmez.
5. Patiler: Bu yer tavşanlarda kullanılmaz. Sıçan ve farede sadece diğer yollar çalışmazsa kullanılabilir. Sadece bir patiye izin verilir ve hayvanlar yumuşak yerde bırakılmalıdır.

Enjeksiyon yeri her enjeksiyondan sonra haftada en az 3-4 kez muayene edilmelidir. Enjeksiyon sayısı ise serumdaki antikor titresiyle belirlenir. Tavşanlar veya diğer hayvanlar için 3-4 enjeksiyon yeterlidir.
Duyarlı hayvanaCFA'nın yeniden enjeksiyonu ağrılı olabilen daha ciddi hipersensivite reaksiyonlarına neden olur. Bu nedenle CFA'nın bir injeksiyonundan daha fazlasını kullanan protokoller bu işlemin temelinde tartışılmalıdır. İnkomplet Freud's Adjuvant'ında ileri aşamaya götüren dozlar düşünülmelidir.

• Sansitizasyondan sonra antijenlerin sulu solüsyonlarının verildiği hayvanlar anaflaktik şokun bulguları bakımından gözlenmelidir ve verilen uygun tedavi akut reaksiyon göstermelidir.
• Enjeksiyonda ciddi iltihabi reaksiyonlar muayene ve tedavi için veterinere rapor edilmelidir

Hibridoma ve Monoklonal Antikor Oluşturma

Bu amaç için fareden başka alternatif yoktur. Hayvanda huzursuzluğu en aza indirecek protokol verilmiştir:
Fare İmmünizasyonu: Genellikle Balb/C fareler kullanılmakta olup 43 - 78 günlük olmalıdır. Ufak miktarda eriyebilen immünojen varsa immünizasyonun başlangıcında CFA kullanılmalıdır. Adjuvanla eşit volümde emülsifiye sulu antijen kullanılır, uygun görülen protokolle 0.05mL enjekte edilir. Antijenin miktarı fazlaysa veya immünojenik antijenler kullanılacaksa başka adjuvanlar (Freud'ün inkomplet adjuvanı) kullanılmalıdır. CFA asla intravenöz kullanılmaz.
İntradermal yol sadece hücrenin aracılık ettiği yanıtı indüklemek için kullanılır. Tek bir yere 0.05 mL'den fazla verilmez. Enjeksiyon yerinde sıklıkla ülserasyona neden olur. Bu yol fare için uygun değildir.
Subkutan yol için farede uygun yer boyun bölgesi olup 0.1 mL'den daha fazla kullanılmaz.
İntramüsküler yol farede CFA için uygun değildir. Enjeksiyon yerine 0.1mL'den fazlası verilmez. İkiden fazla biseps femoris kası kullanılmamalıdır.
İntraperitoneal (i.p.) yol sadece CFA için kullanılır. Enjeksiyonlar 0.1 mL' den fazla olmamalıdır.
Patilere CFA yapılmaz. Bu yol diğer yollar çalışmadığında kullanılabilir. Farede sadece bir pati kullanılabilir. Hayvanlar yumuşak yatakta barınmalıdır.
Her enjeksiyondan sonra haftada en az 3-4 kez enjeksiyon yeri muayene edilmelidir. Enjeksiyon sayısı plazma titrasyonuyla saptanır. Bir çok protokol 3-4 intraperitoneal enjeksiyonu yeterli bulur. Titrasyon 1:100 veya daha fazla ise yeterli kabul edilir. Farenin kuyruğu keskin bir makasla kesilerek heparinize tüpe kan alınır. Bu işlem 3 defadan daha fazla yapılmamalıdır.
Füzyon için hazırlık: Fare servikal dislokasyonla öldürülür. Hücre füzyonu için dalak çıkartılır.
Asit Oluşumu ve Toplanması: Yüksek dozda CFA veya pristan intraperitoneal enjekte edilirse peritonda asit yapımına neden olur. Bu esnada ağırlık kaybı, kamburlaşmış görüntü ve letarji görülür. Klinik bulgular gözlendiği zaman asit oluşturmak için enjeksiyon miktarı gerekli en aza indirilmelidir. Kural olarak fare sadece bir kez pristanla kullanıma hazırlanmalıdır. Pristan enjeksiyonunu tekrar etmek gerekirse bu ilk enjeksiyondan 4 hafta sonra olmalıdır. Her ikisinde de hibridoma hücrelerinin enjeksiyonundan önce kullanıma hazırlamadan sonra bir hafta beklemelidir. Pristan (2,6,10,14-tetrametilpentadekan) i.p. 0.2 mL önerilir; maksimum doz 0.5 mL 'dir. Dengelenmiş tuz solüsyonunda mL' de 3.2x106 olacak şekilde hazırlanan hibridoma hücreleri 0.1-0.2 mL verilmelidir. Pristan hücre enjeksiyonundan en az 14 gün önce 0.5 mL olarak ip yapılmalıdır.
Enjeksiyondan 4-8 gün sonra fare asit yapmaya başlar ve asit yapımı zaman içerisinde oluşmaya devam eder. Asit yapma hızı oldukça değişkendir. Asit sıvısı 22 nolu iğneyle fare karnından boşaltılır. Pıhtılaşmayı önlemek için ufak miktarda heparin tüpe eklenmelidir. Asit sıvısının oluştuğunu saptamak için hayvan günlük muayene edilir; karnında şişkinlik olup olmadığına bakılır. Asit sıvısı hayvanın doğuma yakın oranda karnı büyüdüğü zaman boşaltılır. Sıvının toplanması sedasyonla veya tercihen anestezi altında olmalıdır. Sıvı alınması 3 kez olabilir. Sonuncusunda ötanazi uygulanır. Hayvanlar sürekli rahat ettirilmelidir ve solunumu, aktivitesi, iştahı günlük olarak izlenmelidir. Karın şişliğinin huzursuzluk yaratacak düzeye gelmesine izin vermemelidir. Huzursuzluk saptanırsa anestezi altında son sıvı alınır ve hayvan ötanazi edilir. Asit toplanmasından sonra intraperitoneal veya subkutan serum fizyolojik verilerek hayvanın şoka girmesi önlenir.

Akut Toksisite Testi

Memelilerde kimyasalların/ilaçların akut toksisitesinin tayini için diğer yöntemler güvenli olmadığından böyle bilgi ancak hayvan çalışmalarından elde edilebilir. Çalışma için rasyonel ve spesifik gerekçe bağlı bulunulan etik kurula verilmelidir. İşlem kullanılan hayvan sayısını minimuma indirmeye, hayvanda üretim süresini ve boyutunu en aza indirgemeye göre düzenlenmelidir. Test başlamadan önce etik kurula protokol verilmeli ve onaylanmalıdır.
Üç temel yaklaşım yaygın olarak kullanılır: 1) "limit" veya güvenli test, 2) yaklaşık LD50'yi verebilen aralık bulma testi, veya 3) istatistiksel olarak geçerli LD50.

1. Limit Test, test bileşiğinin önceden tayin edilen doz düzeyinde (genellikle tek büyük bir doz), toksik veya letal olup olmadığını tayin etmek için uygundur. Her cinsiyetten 5-10 hayvana veya hassas cinsiyetten 10 hayvana yasal olarak saptanan doz verilir. Belirli bir süre içerisinde görülen toksik yanıtlar kaydedilir. Sonuçlara göre ek test yapılır. Normal koşullarda bir veya iki hayvan ilk olarak maruz bırakılır ve toksisite gözlenmezse başka hayvanlarla aynı doz, aynı maddenin "güvenirliğini" doğrulamak için kullanılır.
2. Aralık bulma testleri, şayet bileşiğin letalitesi bilinmiyorsa kullanılan hayvan sayısını azaltmak için uygun doz düzeylerini saptamada kullanılmalıdır. Genellikle bir veya iki hayvan her doz düzeyi için yaklaşık LD50'nin tahminine izin verecek doz aralığında kullanılır.
3. LD50 testi, bir maddeye veya ürüne maruz kalındığında meydana gelen akut letaliteyi değerlendirir. LD50 değeri, test hayvanlarının %50'sini öldürmesi beklenen dozdur. Bu yöntem tipik olarak 100 veya daha fazla hayvanda kullanılabilir. Test materyeli artan dozlarda genellikle 5 veya daha fazla dozda, 10 dişi ve 10 erkek hayvan gruplarına verilir. Belirli bir süre içindeki mortalite kaydedilir; istatistiksel yöntem yardımıyla LD50 saptanır. Çeşitli amaçlarlarla bu test yapılır:
   • Güvenli taşıma ve işaretlemede yasal zorunluluklar için madde veya ürünleri test etme,
   • Kimyasal doz-yanıt eğrisinde karşılaştırmalı bilgi sağlamak,
   • Akut intoksikasyon tedavisi için bilgi sağlamak,
   • Bazı biyolojik ürünleri standart hale getirme,
   • Toksisite çalışmaları için doz düzeylerini ayarlama,
   • Alternatif test yöntemini değerlendirme için veri sağlamak.

Tüm bu testlerde hayvanlar yakından hiç olmazsa bir saat boyunca ağrı-sıkıntı bulguları için dozu takiben gözlenmelidir. Şayet sıkıntı veya ağrı beklenmeden oluşursa ve bu nedenle değerlendirilmezse yerel etik kurulu derhal bilgilendirilmelidir. Testin devamı protokolün modifikasyonunu gerektirebilir ve yerel etik kurulca yeniden değerlendirilebilir.
Hayvan, maruz bırakılmadan önce test ajanının saflığı ve içeriği iyi bilinmelidir. Hayvanlar çalışmanın hedefleri ile tutarlı bir süre, gözlem için dozu takiben kullanılmalıdır. Ekseri standart akut toksisite testleri en az 14 gün, bazen daha uzun süre gerektirir (toksisitenin geciken bulgularını tayin için). Ölmek üzere olan hayvanlar öncelikle ağrı veya huzursuzluk bulgusu varsa derhal olabildiğince süratli bir şekilde öldürülmelidir.

Ağrıya Dayalı Deney

Hayvanlarda ağrılı ve stresli deneylerde analjezikler, anestezikler veya trankilizanlar ancak deneysel nesnelerle tepkimeye girmeyeceği zaman kullanılarak hayvan rahatlatılabilir veya yatıştırılabilir. Hayvan çalışma protokolleri, kullanılan ilaçları (veya ilacı) ve dozu belirtmelidir. Şayet ağrı ve stress kaçınılmaz ise, bu ilaçlar çalışmanın yapısına kontrendike ise, sorumlu araştırmacı yerel etik kurulundan gerekçe göstererek izin almalıdır. Kimyasal rahatlatıcı kullanmayı gerektirecek gerekli ağrı düzeyi, ilaç enjeksiyonundan kaynaklanan ağrıdan genellikle daha şiddetlidir. Girişim hayvanda anormal kaçma davranışına, önemli doku harabiyetine neden oluyorsa ağrılı kabul edilir veya insanlarda ağrı yaparsa ağrılı olarak kabul edilir. Hayvanda yapılan girişimler:

1. Ağrısız veya sıkıntısız olabildiği gibi
2. Uygun anestezik, analjezik veya trankilizan ilaçların verildiği ağrı veya sıkıntılı olabilir.

Ağrı veya Sıkıntıya Neden Olmayan ya da En Az Seviyede Geçici Ağrı veya Sıkıntı Veren Uygulamalar

Bu işlemler tanımlanan yöntemleri kullanan ehil kişilerce yapıldığı zaman çok az geçici ağrı yapabilir ya da ağrısız veya sıkıntısız olduğu düşünülebilir:

1. Aşağıdakilerin uygulanmasında,
   • Anestezik, analjezik ve trankilizanlar,
   • Sıvı ve elektrolit tedavisi,
   • İmmünizasyon,
   • Oral tedavi;
2. Kronik olmayan kateterizasyon;
3. Kan alma (intrakardiyak ve bazı türlerde periorbital hariç);
4. Gastrik gavaj;
5. Veterinerlerin tanı ve tedavi için yaptıkları bazı rutin uygulamalar (örneğin enjeksiyonlar; palpasyon, röntgen, deri sıkma),
6. Önerilen yönteme göre yapılan ötanazi;
7. Neonatal kemirgenlerde intraserebral inokülasyonlar. Birçok neonatal kemirgende intraserebral inokülasyonlar eğitilmiş personel tarafından yapılabilir. Bu uygulama sadece geçici ağrı veya sıkıntıya neden olur. Yukarıdaki işlemlerin herhangi birinin sonucu ağrı veya sıkıntı olursa bu işlem aşağıdaki kategoride değerlendirilmelidir.

Uygun Tedaviyle Rahatlatılan Ağrı veya Sıkıntı Oluşturan Uygulamalar

Ağrı veya sıkıntıya neden olan ve analjezik, anestezik veya trankilizanlarla uygulamaların yapılabildiği işlemler şunlardır:

1. Biopsi, gonadektomi, elektrot ve kayıt aletlerinin yerleştirilmesini içeren tüm cerrahi uygulamalar,
2. Yanık, donma ve dağlama uygulamaları,
3. Kemik kırıkları,
4. İnsanlarda genellikle ağrıya neden olduğu kabul edilen elektrik şokları,
5. Aşırı iltihap ve nekroza neden olan bir ajanın kullanımı,
6. İlaç veya radyasyon toksisitesinin LD50 tayini için yapılan testler,
7. Adaptasyon işlemine girmeyen hayvanlarda 12 saatten daha uzun süre harekette kısıtlama,
8. Deri veya korneanın aşınma testi,
9. İntrakardiyak kan alma,
10. Fare ve hamster dışındaki herhangi bir türden periorbital kan alma. Fare ve hamster gibi gerçek orbital sinüse sahip olmayan anestezi edilmemiş hayvanlardan periorbital kan alma uygun değildir.

Hayvanların Genel Bakımı ve Düzeni

Deneyde kullanılacak hayvanın araştırma süresince bulunduğu yerde hareket özgürlüğü olmalı; yiyecek ve suyu sağlanmalıdır. Sağlığının iyi olması için her türlü bakım yapılmalıdır. Fizyolojik gereksinimleri (işemesi, dışkılaması, vücut sıcaklığını devam ettirmesi, normal hareket ve postür ayarlamaları gibi) olabildiğince kısıtlanmamalıdır. Hayvanlar günlük olarak kontrol edilmeli; ağrı, sıkıntı veya acısı varsa hızla düzeltilmelidir.

Hayvanların Yeniden Kullanılması

Hayvanın yeniden kullanılması, ilk uygulamadan sonra farklı ikinci bir uygulamanın yapılmasıdır.

• Kullanılan bir hayvan normal sağlığına kavuşsa bile, başka bir araştırmada asla kullanılmaz.
• Sağlıklı, kullanılmış hayvandan ancak eğitim amacıyla yararlanabilir.

Hayvan Ürünlerinin Kullanımı

Araştırmacılar hayvan kaynaklarından elde edilen materyallerle çalıştıkları zaman, hayvan sayısını en az kullanmaya özen göstermelidir.

Personelin Sorumlulukları

Araştırmada deney yaparak, test ederek veya dokuyu sağlayarak deney hayvanı kullanan herkes hayvanın en üst düzeyde sağlığını ve korunmasını sağlamakla yükümlüdür. Tüm araştırma süresince hayvanın taşınması ve sonraki bakımı da özenli yapılmalıdır.

Eğitim, Alıştırma ve Yetki

Araştırmacı, araştırmayı destekleyen ve hayvanların bakımını yapan herkes, gereksinim duyulan sorumluluk düzeyinde eğitilmelidir. Eğitim, alıştırma veya ileri düzeyde alıştırma, kullanılan hayvanların bakım işini bilen kişi tarafından veya o kişinin gözetimi altında yapılmalıdır. Araştırmacı deneyimli değilse, deney hayvanlarının uygun kullanım yöntemlerini öğrenmeleri için bu konuda yeterliliği saptanmış kurumlardan eğitim alması gereklidir.

Hayvanların Sağlanması

Hayvanlar üretim ve satış yapan merkezlerden elde edilmelidir. Bu hayvanlar kendinize ait diğer laboratuvar hayvanlarının yanına asla konmamalıdır. Araştırmada kullanılan tüm omurgalı hayvanların doğum tarihi veya stokunun kaydı yapılmış olmalıdır.

• Yabani türler araştırmada kullanılmaz. Ancak çok özel koşullarda ve araştırıcının başka alternatifinin olmadığı durumlarda bu hayvanlar, yerel etik kurulun özel izniyle kullanılabilir.
• Üretim; sayı, cinsiyet ağırlık, sağlık vb araştırma gereksinimlerini karşılayacak şekilde düzenlenmelidir. Özellikle fazla doğum ve gereksiz ayırma işlemi yapılmamalıdır.
• Kemirgen olmayan hayvanlarda yapılacak büyük cerrahi girişimler sadece Araştırma Merkezinde yapılmalıdır. Kemirgenlerde gerçekleştirilen hayvan deneyleri sorumlu araştırmacı tarafından daha önceden belirlenen yerde yerel etik kurulun izni ve denetimiyle yapılabilir.